TÉCNICAS DE EDICIÓN GENÓMICA PARA DIABETES MELLITUS MITOCONDRIAL

CRISPR / Cas9 en modulación  Trans-epigenética

Esta tecnología de edición genómica CRISPR/Cas9 permite activar genes sin crear rupturas en el ADN. Algunos investigadores han empezado a utilizar una forma “muerta” de Cas9 (dCas9), que puede dirigirse a lugares específicos en el genoma y acoplarse a los dominios de activación transcripcional que activan genes específicos. Cas9 o dCas9 se empaquetó en un AAV, y los interruptores y el ARN guía, en otro. También optimizaron los ARN guía para asegurarse de que todas las piezas terminaran en el lugar deseado en el genoma, y ​​que el gen diana fuese fuertemente activado. De esta manera, la tecnología funciona a nivel epigenético, lo que significa que influye en la actividad de los genes que causan enfermedades como la diabetes mitocondrial. 

REFERENCIAS 
In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation
El rediseño de una técnica de edición genética permite crear una herramienta de medicina de precisión que no daña el ADN

TERAPIA CON STEM CELLS EN DIABETES MELLITUS MITOCONDRIAL

Diabetes de Herencia Materna y Sordera (DHMS)

Se recolectaron células de la piel de pacientes con diabetes mitocondrial y, a través de una técnica basada en la sustitución mitocondrial mediante transferencia nuclear, generaron células madre embrionarias con mitocondrias sanas que experimentaron remodelación a través de la fisión mitocondrial y la mitofagia.  Esto permite reemplazar el tejido de la enfermedad en pacientes al eliminar una célula, corregir las mutaciones dentro de ella, multiplicarla y reintroducir las células genéticamente correctas resultantes en el paciente. Esta tecnología se ha aprovechado para eliminar los ADN mitocondriales mutantes, lo que supone un paso importante hacia las intervenciones terapéuticas para pacientes con enfermedades mitocondriales.

REFERENCIAS

Mitochondria: More than Just “Power Plants” in Stem Cells

Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease

New Breakthrough in Stem Cell Therapy for Mitochondrial Diseases

ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA Y ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA 

Recombinación V(D)J

Es un proceso de recombinación del ADN que ocurre durante la maduración de los linfocitos para generar una gran diversidad de anticuerpos. Los genes que codifican para los receptores de antígenos de las células B y T están separados en diferentes segmentos génicos en varios cromosomas. Así, las regiones variables de los receptores de antígenos se ensamblan mediante la unión de un segmento variable (V), un segmento de unión (J) y un segmento de diversidad (D) de línea germinal. Esta recombinación del tipo V(D)J se inicia por acción de una endonucleasa específica presente exclusivamente en linfocitos inmaduros.

ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL EN DIABETES MELLITUS MITOCONDRIAL O DIABETES DE HERENCIA MATERNA Y SORDERA 

Insulina Glargina

Una forma de tratar a la diabetes mitocondrial es el uso de insulina recombinante como la insulina glargina. Esta es un tipo de insulina de acción prolongada con un inicio de 1 hora, sin hora pico y una duración de 20 a 26 horas. Es producida por una cepa de laboratorio de Escherichia coli no patógeno en el que se han insertado el gen de la insulina humana ligeramente modificado. La insulina glargina difiere de la insulina humana regular ya que se ha sustituido el aminoácido asparagina de la posición A21 por una glicina y se ha añadido dos argininas al carboxilo terminal de la cadena B. La insulina Glargina también evita que el hígado produzca más azúcar.

REFERENCIAS: 
Generación de diversidad de los receptores de antígeno en linfocitos: validación del «modelo de accesibilidad» en el control de la recombinación V(D)J
Determinación de la clonalidad en tejidos humanos
Insulina glargina (origen ADNr) inyectable
INSULINIZACIÓN EN LA DIABETES MELLITUS TIPO 2 ALTERNATIVAS DE INTENSIFICACIÓN

PRUEBA MOLECULAR DE SECUENCIACIÓN DE DIABETES MELLITUS MITOCONDRIAL

Diabetes de Herencia Materna y sordera (DHMS/MIDD)

SECUENCIACIÓN SANGER

En la Diabetes Mitocondrial el análisis genético debe comenzar por el análisis de las mutación puntual relacionada. Para este caso pueden emplearse técnicas moleculares como la secuenciación Sanger del gen implicado. La secuenciación Sanger del gen MT-TL1 pone de manifiesto la presencia en heteroplasmia de dicha mutación, lo que confirma el diagnóstico de MIDD. El proceso consiste en que  el ADNmt blanco es copiado muchas veces y se hacen fragmentos de diferentes longitudes. Después nucleótidos fluorescentes que actúan como "terminadores de cadena" marcan los extremos de los fragmentos y permiten la determinación de la secuencia.

REFERENCIAS: 

Mitochondrial genetics

RELACIÓN ENTRE EL NIVEL DE HETEROPLASMIA DE LA MUTACIÓN m.3243A>G EN DIFERENTES TEJIDOS Y EL FENOTIPO EN FAMILIAS CON DIABETES Y SORDERA DE HERENCIA MATERNA (MIDD) Y MELAS

ENFERMEDADES MITOCONDRIALES

ANÁLISIS DE UN ARTÍCULO DE PCR SOBRE DIABETES MELLITUS MITOCONDRIAL

Diabetes de Herencia Materna y Sordera (DHMS)

TEMA: Glomeruloesclerosis segmentaria focal asociada con diabetes y sordera heredadas por la madre: análisis clínico patológico.

OBJETIVOS: Determinar la relación de glomeruloesclerosis con DHMS, investigar las características clínicas y las anomalías del ADN mitocondrial para el probando y su madre.

TIPO DE MUESTRA BIOLÓGICA: Sangre periférica

TIPO DE ÁCIDO NUCLÉICO: ADN mitocondrial extraído con el sistema  GeneAmp PCR 9600  (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA).

GEN O SECUENCIA A AMPLIFICAR: MT-TL1 (Gen que codifica para tRNA mitocondrial para la leucina) (429 pb)

TIPO DE PCR: PCR-RFLP

Inicial: 1 min a 94°C

35 ciclos:

D: 94°C por 30 segundos

H: 53-62°C por 60 segundos

E: 72°C por 10 minutos

Los fragmentos amplificados fueron digeridos con endonucleasas de restricción (ApaI, AflII, BglI, or HpaII; Takara Biomedical)

VISUALIZACIÓN: Electroforesis en gel de agarosa al 2%

PRIMERS UTILIZADOS EN EL ESTUDIO 

REFERENCIAS: 
Focal segmental glomerulosclerosis associated with maternally inherited diabetes and deafness: Clinical pathological analysis

PRUEBA DE TAMIZAJE Y PRUEBA CONFIRMATORIA DE DIABETES MELLITUS MITOCONDRIAL

Diabetes de Herencia Materna y Sordera (DHMS)

PRUEBA DE TAMIZAJE

Una medición de la glucemia en ayunas permite el diagnóstico de la diabetes: un nivel de 100 a 125 mg/dl indica  prediabetes y un nivel de 126 mg/dl casi siempre significa diabetes. Además, un análisis oftalmológico revela la distrofia macular específica, presente en la diabetes mitocondrial. El diagnóstico de las formas comunes de diabetes tipo 1 y 2 queda eliminado  debido a la existencia de sordera, el bajo índice de masa corporal, la distrofia macular reticular y por la evidencia de la transmisión materna. 

PRUEBA CONFIRMATORIA

La determinación de la mutación m.3243A>G  en el gen MT-TL1 es una prueba confirmatoria de diabetes mitocondrial, la cual se puede realizar mediante la técnica de PCR-RFLP a través de la observación en un gel de agarosa de 3% del corte parcial del producto de PCR original (429 pb) con la enzima de restricción Apal en dos fragmentos de 312 y 117 pb. También para estimar de forma más exacta el grado de la heteroplasmia, se puede utilizar una técnica de cuantificación basada en PCR de tiempo real.

REFERENCIAS: 

Actualización en el diagnóstico de la diabetes

Diabetes de herencia materna y sordera

Heteroplasmia de la mutación del ADN mitocondrial m.3243A>G en la diabetes y sordera de herencia materna

ALTERACIONES DE LA EPIGENÓMICA EN DIABETES MELLITUS MITOCONDRIAL

Diabetes de Herencia Materna y Sordera (DHMS)

Un mal estilo de vida, desde inapropiada dieta rica en grasas y azúcares, tabaco, alcohol y sedentarismo, pueden provocar la mutación del gen MT-TL1 causando diabetes mitocondrial. Esta enfermedad es transmitida por herencia materna exclusivamente, afectando a toda su descendencia, a  pesar de que ésta tenga un  estilo de vida adecuado combinado con una buena dieta y actividad física. La presencia de esta enfermedad en personas saludables se debe a alteraciones en la epigenómica del ADN mitocondrial, que pueden ir desde una hipermetilación del mtADN o relacionarse con estrés oxidativo aumentado por los radicales libres que se producen en la mitocondria. 

REFERENCIAS: 
La obesidad materna y problemas metabólicos asociados podrían heredarse a través del ADN mitocondrial del óvulo
Interacción genoma-ambiente en la génesis de la diabetes mellitus tipo 2
ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS EPIGENÉTICOS EN LA METILACIÓN DEL DNA INDUCIDOS POR LA DIABETES Y SUS POSIBLES MECANISMOS
Mecanismos de regulación epigenética del ADN mitocondrial